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【重磅综述】单细胞分辨率下的免疫衰老

2022-02-19 18:01   编辑:admin   人气: 次   评论(

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  免疫系统是身体的“护卫”,各类细胞相互协作保护机体免受感染。然而随着衰老,免疫系统的协调能力受到破坏,其发挥的作用也逐渐减弱。免疫系统是复杂多样的,它的衰老过程更是异质性的,传统方法难以解析免疫系统在衰老中的精确变化。运用单细胞技术和生物信息技术,使我们得以从中窥见这一纷杂却运作精巧的免疫系统是如何变得衰老的。接下来,小编给各位读者分享一篇关于单细胞技术和免疫系统衰老的综述,它由美国华盛顿大学医学院病理与免疫学系的Maxim N. Artyomov教授课题组于2021年11月23日发表在Nature Reviews Immunology杂志,题为“Immune ageing at single-cell resolution”。

  衰老会导致免疫系统发生极大的改变,增加人们对一些慢性病、传染病和自身免疫病的易感性。近年来,单细胞技术的广泛应用使我们对衰老免疫系统的认识取得了实质性进展,这些方法也更加详细地阐述并拓展了目前关于免疫衰老的观点。本文回顾了最近相关的研究,这些研究在单细胞分辨率下利用无偏倚技术探索了免疫系统是如何衰老的。具体来说,文章讨论了年龄相关性的先天性和适应性免疫细胞群、抗原受体库和支持免疫细胞的外周组织微环境这几个方面改变的一些新认识。本篇综述主要讨论了在小鼠和人类身上获得的研究结果,描述了符合免疫衰老既定概念的多维数据,并进一步讨论了该领域中悬而未决的问题,着重介绍了有利于加深我们对免疫衰老理解的技术。

  衰老是一个发生在器官、组织和细胞多个层次的,同时经历大量重构的多模型进程,而传统分子生物学方法难以精确解析这一过程。生理完整性的丧失、组织稳态的紊乱以及包括免疫系统在内的各种生理系统的日益恶化都是衰老的主要特征之一,这些变化共同重塑了生理和免疫状况,并增加了对某些疾病和多重病症的易感性。有趣的是,并不是所有的免疫过程对衰老的敏感性都是一致的,这表明在年龄较大的生物体中(例如 ≥ 65岁的人类和 ≥ 1.5岁的小鼠),不同的免疫细胞群会受到不同程度的损伤。目前,多组学和单细胞技术的发展(框1)和高通量生物学与系统免疫学的进步,使全面表征免疫系统细胞和功能的异质性在衰老过程中的动态变化成为了可能。包括单细胞RNA测序(scRNA-seq)(框2)在内的新技术已经证实了先前的发现,并扩展了先前基于靶向研究证据的衰老和免疫方面的现有范式。在这篇综述中,我们总结了对衰老免疫系统理解的最新进展,并讨论了已报道的单细胞数据和分析与现有概念的一致性。我们将重点分析从哺乳动物模型中获得的单细胞测序结果,并在可能的情况下,讨论如何将这些发现转化应用于研究人类免疫系统衰老。

  在衰老的生物体中,没有病原体且低水平的全身性炎症是免疫衰老的标志,通常被称为“炎性衰老”。炎性衰老的特征是促炎因子和抗炎因子的不平衡,这极大地预示着死亡和慢性疾病风险(图1)。炎性衰老的概念最初是建立在相对较少的炎症因子的测量上,而无偏倚分析研究完全证实了这一现象。最近的一项研究在小鼠生活史的10个时间点对17种组织进行了转录组RNA测序和血浆蛋白质组学分析,以识别具有一致生物学功能的、聚集在一致轨迹组中的年龄相关基因。与之前的结果一致,该分析确定了两个与免疫反应相关的不同基因簇,它们在小鼠从中年向老年过渡时迅速上调。这些转录的改变可能反映了免疫细胞向衰老组织的主动浸润和随之而来的全身炎症。有趣的是,这些细胞聚类中的表达在脂肪组织中,尤其是在内脏脂肪沉积中变化幅度最大,这表明脂肪相关的巨噬细胞和脂肪细胞可能是炎症的关键调节因子之一。除了免疫细胞浸润外,炎性衰老还可能由年龄相关的重塑导致基本组织结构的改变引起。广泛地说,在许多组织中,有着纤维化结构和衰老细胞积聚,但一些组织也具有一系列明显的免疫改变的特征。例如,据报道,在小鼠中I型干扰素信号随着年龄增长而增加,特别是在脉络膜丛中,这种炎症性重塑与衰老过程中的认知能力下降有关。

  对一组分子(如DNA、RNA、蛋白质和代谢物)的综合评价统称为多组学。流式细胞术是历史上第一个基于单细胞的技术,能够同时识别单个细胞的5-20个特征。通常情况下,流式细胞术实验使用荧光偶联抗体来检测表面和细胞内的表位和/或荧光探针来测量细胞特征,如丰富的DNA、线粒体、溶酶体和脂滴。质谱流式细胞技术,又称飞行时间流式细胞术,是流式细胞术的一种变体,它依赖于带有重金属离子标签的抗体,可以在单个细胞中测量多达40个单独的表位。在过去的十年中,基于单细胞的组学的无偏倚应用得到了广泛的发展。其中单细胞RNA测序(scRNA-seq)是一项快速发展的技术,可以检测和定量测量每个细胞500-5,000个最高表达的转录本。计算分析单个细胞的转录组可以识别新的细胞群,细胞激活状态和免疫细胞的分化过程。scRNA-seq技术的变体除了可以在单细胞分辨率下测定RNA的转录水平,还可以鉴定T细胞受体或B细胞受体(称为单细胞T细胞受体测序和单细胞B细胞受体测序),这对抗原受体的相关研究十分有帮助。通过测序对转录组和表位进行细胞索引是一种利用寡核苷酸标记抗体将细胞蛋白和转录组测量结果整合成单细胞数据的解析方法。从理论上讲,它可能会扩展到同时测量数千种蛋白质和转录本。最近新兴的利用DNA转座酶结合高通量测序技术,来研究染色体的可及性的单细胞分析技术(ATAC),可以分析单个细胞的表观遗传图谱。此外,在单个细胞中结合转录信息和表观遗传特征的单细胞技术也已经发展起来。而这些单细胞方法有一个重要的局限性,即需要使用细胞悬浮液或单独的细胞核,并需要器官的分解,这导致了与细胞解剖定位相关的空间信息的丢失。将位置信息添加到单细胞实验中是多组学免疫领域的下一个前沿。因此,空间质谱流式细胞技术(成像质谱流式细胞技术)和空间转录组是两个快速增长的领域,这将有助于整合组织切片中的转录和蛋白质组信息,将单个细胞或细胞群的多模态特征与组织结构的复杂性结合起来。

  衰老与循环系统中造血干细胞(HSCs)向髓系细胞而非淋巴系细胞分化的倾向增强有关(表1),这种变化一定程度上是由于新生T细胞分化所需的胸腺活性下降所导致。同时,年龄对骨髓中早期髓系和淋系细胞的形成也有不同的影响。老年小鼠骨髓的变化导致造血干细胞向髓系的克隆倾斜。小鼠骨髓基质微环境的RNA测序分析显示,年龄驱动的促炎基因(包括Il6和Il1b)的渐进式上调,这可以向具有髓系潜能的造血干细胞转移。事实上,在单细胞分辨率下对年轻骨髓微环境的分析表明,应激诱导的分子途径的改变(如Dll1和Dll4编码的Notch配体Delta样蛋白下调)也启动了小鼠造血干细胞的髓系转录程序。这些和其他类似的应激相关分子通路可能是在衰老过程中造血微环境中造血干细胞髓系偏倚的积累基础。然而,这些发展变化并不意味着炎症的出现。例如,考虑到这些细胞在年轻和年老的健康个体中表现出类似的转录谱,人类的衰老似乎与循环单核细胞向促炎表型的转换没有关系。这就需要在单细胞分辨率下对人类造血干细胞的衰老做进一步的研究,以更好地理解在老年人中骨髓生成的调控机制。

  衰老也与组织驻留的骨髓细胞亚群的改变相关(图2)。scRNA-seq分析发现了组织驻留的髓系细胞之间的异质性,特别是在炎症反应时,老年小鼠间质巨噬细胞表达趋化因子受体基因Ccr2和Cx3cr1的比例增加,而肺泡巨噬细胞比例减少(表1)。此外,老年小鼠的肺泡巨噬细胞高表达基因,如Spp1(编码骨桥蛋白)和Ccl3,起到了促进炎性衰老的作用。在老龄小鼠乳腺组织中,胎源性组织内巨噬细胞的比例显著降低。相比之下,髓系巨噬细胞的比例没有改变,但这些细胞显示出促炎基因(如Ccl5和Gdf15)的表达增加。在腹膜腔中,scRNA-seq发现,老龄小鼠相比于幼龄小鼠,腹膜巨噬细胞(起源于胚胎前体细胞且表达Icam2)的数量显著减少,此外,对衰老小鼠的单细胞分析表明,肝脏巨噬细胞(也被称为Kupffer细胞)的炎症功能(包括细胞因子基因Il1b的表达)增强,这可能会促进肝脏炎症和损伤。因此,老年小鼠的组织环境通常与胚源前体组织内巨噬细胞亚群取代单核细胞来源亚群有关,它们的转录程序转向促炎表型,促进了炎症的发生,进一步了解这些巨噬细胞谱系在人类衰老过程中在各种器官中的命运至关重要。

  在一定程度上,衰老生物体中骨髓细胞群的促炎转移可能依赖于衰老对生理过程的影响,并可能通过系统干预加以改善,如饮食限制,包括限制卡路里摄入。最近关于限制热量摄入对衰老大鼠多个组织影响的单细胞转录组学分析表明,限制热量摄入可以抑制年龄相关性炎症。具体来说,该研究表明,热量限制逆转了衰老M1型巨噬细胞的促炎极化,增加了具有高吞噬活性的抗炎巨噬细胞的比例,并改变了巨噬细胞和基质细胞之间的配体-受体依赖的通信。当前仍需要进一步的研究来探究热量限制和类似干预对老年人骨髓细胞群体的影响。

  中性粒细胞也是重要的骨髓细胞,尽管通常寿命较短,但也可能受到衰老的影响。中性粒细胞的发育和数量似乎不会随着年龄的增长而发生系统性的改变。然而,在老年人中,中性粒细胞的吞噬活性和杀灭细菌的能力有所下降。此外,最近的研究表明,组织环境中与年龄相关的变化可以重编程中性粒细胞。在小鼠中,衰老通过CXCL1调控的过程干扰了损伤组织中的中性粒细胞上皮间迁移,导致中性粒细胞异常转运和随后的远端器官损伤。CXCL1还将中性粒细胞招募到老年小鼠的肝脏中,通过产生活性氧来诱导组织衰老和炎症。炎症相关趋化因子CXCL1、组织损伤和异常中性粒细胞功能之间的这种相互作用可能会促进老年慢性炎症的发展。此外,最近的一项多组学分析研究表明,存在显著的年龄相关性骨髓中性粒细胞重构,这表明衰老的骨髓微环境在年龄相关的中性粒细胞失调中发挥作用。

  在其他与衰老相关的细胞表型中,中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DCs)的吞噬活性紊乱,以及它们吞噬凋亡细胞的能力降低已在小鼠和人类中被描述。在老年小鼠的脾脏中,发现经典I型树突细胞,而非经典II型树突细胞的数量减少了。然而,老年个体的树突状细胞亚型是否表现出抗原呈递能力的特异性改变仍存在争议。

  先天淋巴细胞(ILCs)包括自然杀伤细胞(NK)、第1亚群ILCs (ILC1s)、第2亚群ILCs (ILC2s)和第3亚群ILCs(ILC3s)。ILCs通过细胞因子的分泌以及与其他免疫细胞和基质细胞的相互作用在组织免疫中发挥着独特的作用。然而,令人惊讶的是,很少有人知道ILCs在衰老组织稳态中的作用。老年人(≥60岁)NK细胞的年龄相关变化包括向更成熟的CD14+ CD56 hi亚群转变,同时细胞因子分泌减少,细胞毒性降低,尤其是穿孔素释放减少。在小鼠中,至少有一些与年龄相关的NK细胞功能改变是由衰老的环境所决定的。事实上,NK细胞转移实验表明,衰老的环境会干扰NK细胞的成熟和增殖。与这些观察结果一致,脾、肺和肝脏免疫细胞的scRNA-seq分析显示老年小鼠NK细胞比例下降。这些数据表明,衰老环境一般有抑制NK细胞稳态的能力。NK细胞数量的减少可能导致老年人的抗病毒免疫功能受损。有趣的是,NK细胞的组织特异性增殖和积累发生在不同的衰老生态位,如人类和小鼠衰老大脑的齿状回神经源生态位。scRNA-seq分析显示衰老齿状回中NK细胞的活化和细胞毒性增强。此外,小鼠NK细胞消除了衰老的神经母细胞,并介导了与年龄相关的认知功能衰退,这为衰老机体中NK细胞的细胞毒性增强提供了有力的证据。

  ILC1s是一类非细胞毒性细胞,能产生干扰素γ (IFNγ),是抵抗病毒和某些细菌的第一道防线。与NK细胞相似,老龄小鼠的肝脏ILC1数量减少。常驻肝的ILC1s通过IFNγ驱动的机制从SCA1+MAC1+HSCs局部发展而来。目前尚不清楚衰老环境中的哪些信号干扰了ILC1的发育,以及老年小鼠和人类其他器官中的ILC1s是否受到影响。ILC2s参与抵抗寄生虫的先天免疫反应并调节组织稳态。对小鼠的单细胞分析显示,在衰老的肺和脂肪组织中,ILC2s的含量较少。然而,ILC2整体减少并不是老龄化的普遍标志;例如,老龄小鼠大脑中ILC2s的数量是增加的。衰老增加了骨髓中ILC2s的早期发育,组织中ILC2数量的减少可能是由于趋化迁移功能紊乱所致。在功能上,ILC2s似乎与更健康的衰老表型相关。在年老的脂肪组织中,ILC2s数量的减少与新陈代谢障碍有关,在年老的老鼠中,低温诱导的致死率会加剧。然而,在衰老的大脑中,ILC2s的功能是对抗认知能力的下降。在人类脂肪组织中已经发现了ILC2s,但尚不清楚它们是否会导致老年人与年龄相关的代谢功能障碍。

  随着新一代测序技术的迅速发展,单细胞RNA测序(scRNA-seq)方法近年来也不断发展。单细胞分离是scRNA-seq的第一步。在过去,利用荧光激活细胞技术对数百个单个细胞进行分选是早期的策略之一,它依赖于单克隆抗体的可用性,以识别感兴趣细胞上表达的蛋白质。微流控技术作为一种更有效的变体,最近在低成本分离单个细胞方面变得流行起来。其中一项微流控技术,Fluidigm C1,可以在一个芯片上为多达800个细胞提供单细胞分离、RNA提取和cDNA合成。另一种流行的单细胞分离方法是基于微滴的微流控体系,这种方法允许液滴在油相中分散,比标准的微流控芯片需要更小的体积,并且可以过滤数千到数百万个细胞。商业微液滴微流体系统的一个例子是10X Genomics公司的Chromium系统,它可以将细胞或细胞核的悬浮液作为输入。随后的步骤包括细胞裂解、mRNA逆转录合成第一链cDNA、第二链合成和PCR扩增cDNA、生成scRNA-seq文库。一些scRNA-seq方法在转录本上产生全长覆盖(如Smart-Seq2),而其他方法将测序覆盖范围限制在mRNA的3或5个区域(如10 X Genomics 平台)。最主流的scRNA-seq建库方法也有着一定的局限性,即只能捕获带有poly(A)尾的mRNA。虽然大通量RNA-seq可以检测汇集细胞样本中mRNA表达的几乎全基因组水平,但scRNA-seq不能测量单个细胞中大多数基因的表达水平。事实上,测序深度通常能可靠地识别出每个细胞中有限数量的高表达转录本(通常为1,000-5,000个独立转录本)。由于scRNA-seq技术的不断发展,不同时期的分析结果在测序深度上可能存在差异,在比较scRNA-seq早期和晚期版本的结果时存在技术限制。在最新技术变体中,在逆转录步骤中加入独特的分子标识符(随机的16 bp序列,也称为条形码),消除了PCR扩增步骤中的技术偏差,并提高了测序的准确性。最近也有其他对scRNA-seq在免疫系统分析中的应用进行了更详细的阐述的综述发表。

  图1 炎性衰老的细胞和分子组成。低度慢性全身性炎症/炎性衰老由多种炎症因子组成,这些炎症因子产生于衰老生物体的不同细胞。衰老的促炎组织巨噬细胞会产生细胞因子和趋化因子,同时衰老细胞分泌过多的促炎成分和基质金属蛋白酶(MMPs)等衰老相关分泌表型的成分。此外,非免疫细胞,如脂肪细胞、脂肪细胞前体和基质细胞(包括成纤维细胞和内皮细胞),通过分泌可溶性炎症因子和改变衰老器官的组织微结构,从而促进炎症的发生。促炎趋化因子会驱动组织中过度的免疫细胞浸润,其中细胞因子(如IL-6和IL-1β)和免疫调节因子(如前列腺素E2(PGE2))将免疫细胞亚群重编程为促炎和功能失调状态。反过来,功能失调的免疫细胞,包括巨噬细胞和T细胞,会进一步扩大衰老组织中的炎症和破坏过程。这种炎症细胞和分子成分之间的相互作用最终导致各种器官功能的进行性衰退,并导致与年龄相关的疾病。

  年龄相关的CD8+记忆性T细胞:CD8+T细胞对抗病毒和抗肿瘤免疫至关重要,在小鼠和人类中都会受到衰老的严重影响。一般说来,衰老与幼稚CD8+T细胞的丧失、记忆亚群克隆性细胞总数的增加有关。最近,通过对4种组织(脾、腹膜、肺和肝)的scRNA-seq和单细胞T细胞受体(TCR)测序,综合表征了与年龄相关的小鼠免疫T细胞亚群的重构。这些数据证实了4种组织中幼稚CD8+T细胞丰度的下降,并定义了一个独特的与年龄相关的CD8+T细胞亚群(研究作者将其称为‘Taa细胞’),其独特的特征是检查点受体PD1和转录因子TOX的共同表达。这些与年龄相关的PD1+TOX+CD8+T细胞虽然在幼鼠中缺失,但在老年动物的多种组织中积聚,包括脾、肝、肺和脂肪。它们占这些组织中所有CD8+T细胞的60%,是衰老免疫系统中影响多个组织的系统性变化的显著因素。这一观察结果与Tabula Muris Senis 团队和Calico Life Science 提供的器官范围的单细胞分辨率图谱数据是一致的,虽然这些研究没有对CD8+T细胞衰老进行详细分析。年龄相关的CD8+T细胞表现为T细胞耗竭的表型,其特征是高水平表达TOX、PD1、淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG3)和带有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT),这意味着经典效应功能的丧失。然而,在TCR刺激下,它们会产生一套独特的促炎分子,如颗粒酶K(GZMK)和CCL5。这表明,这些细胞在小鼠衰老过程中作为促炎信号的来源发挥了作用,这可能在年老组织重塑或急性感染的情况下特别重要。

  在人类中,大多数研究集中在循环系统CD8+T细胞的衰老,并使用质谱流式细胞术和scRNA-seq来分析外周血单核细胞(表1)。例如,最近对健康志愿者的scRNA-seq研究报告表明,与年轻人相比,老年人外周血单核细胞中原始的CD8+T细胞比例降低了2倍。另一项研究使用转录组和表观遗传水平的细胞测序索引(CITE-seq)来表征年老和年轻的外周血单核细胞,还显示了幼稚CD8+T细胞的丰度随年龄降低和中央记忆T细胞的显著重塑。具体地说,在健康个体中,表达GZMK而不表达颗粒酶B(GZMB)的CD8+效应记忆T细胞(TEM细胞)相对于整体CD8+T细胞随着年龄的增长而成比例地增加。最近对156名健康人群进行的一项大规模横断面衰老队列的质谱流式细胞研究证实了这些观察结果,并发现循环中表达GZMK的CD8+T细胞和CD8+中枢记忆T细胞的丰度随着年龄的增长而逐渐增加。值得注意的是,GZMK+CD8+T细胞表达CD28,但缺乏CD57,并且与CD45RA+TEM细胞不同——报道称暴露于巨细胞病毒的老年人(21-96岁)中CD45RA+TEM细胞随年龄增加,但在一组健康人(25-80岁)中并不显著。

  尽管表达GZMK的人CD8+TEM细胞在某些方面与小鼠年龄相关的PD1+TOX+GZMK+CD8+T细胞相似(如EOMES和GZMK的高表达),但在人类中,仅凭PD1的表达不能确定这一细胞亚群。小鼠和人类CD8+T细胞衰老情况之间的差异可能是因为,与实验室小鼠不同,人类在一生中经历了多种免疫挑战,这形成了一个更广泛、更多样化的抗原经历型记忆T细胞池。

  与CD8+T细胞相似,在小鼠和人类中,幼稚CD4+T细胞的比例随着年龄的增长而下降,记忆型细胞群随着年龄的增长而增加。这种向记忆表型的转变似乎是由胸腺输出减少和终生抗原暴露的累积效应共同推动的,因为携带转基因TCR的CD4+T细胞即使在老龄小鼠中也往往保持幼稚CD4+T表型。与年龄相关的CD4+T细胞重塑的另一个明显特征是脾脏和淋巴结中调节T细胞(Treg细胞)丰度的增加。然而,在衰老的小鼠的肺或肝中没有观察到Treg细胞丰度的增加。脾脏Treg细胞的积聚被认为在削弱老年动物的免疫反应中发挥作用(例如影响对利什曼原虫主要感染的免疫调控)。最近的一项研究使用scRNA-seq分析了小鼠脾脏CD4+T细胞的衰老,并报道与年龄相关的增加并不是所有Treg细胞的特征,而主要是激活的Treg细胞亚群之一。这些激活的Treg细胞是由Foxp3、Cd81、Cd74和编码激活标记的基因(如Tnfrsf9)的过度表达来定义的。在老年小鼠中,激活的Treg细胞的数量大约是静止Treg细胞的10倍,并且与静止的Treg细胞相比,其抑制免疫活性更强。

  免疫激活的Treg细胞的积累与细胞毒性CD4+T细胞同步显著扩增。这些细胞的特点是表达Eomes和Gzmk,在刺激下不仅能产生干扰素γ和肿瘤坏死因子(TNF),而且还能产生细胞毒素GZMB和穿孔素。与激活的Treg细胞相似,在单细胞技术之前,细胞毒性CD4+T细胞亚群被认为与衰老无关。值得注意的是,衰老的人类CD4+T细胞的scRNA-seq发现了一个相似的细胞毒性CD4+T细胞亚群,这些细胞在110岁以上的人群(超级百岁老人)中显著增多。与之相对应的,单细胞TCR测序数据表明,CD4+T细胞随年龄增长的克隆性增殖主要局限于细胞毒性CD4+T细胞亚群。相比之下,其他T辅助细胞亚群保持克隆性多样性,即使在超级百岁老人中也是如此。有趣的是,在中度症状的老年新冠肺炎患者中(年龄在32-91岁),细胞毒性T细胞亚群也比患有严重疾病的患者更丰富,这可能表明这些细胞在病毒感染期间是有益的。

  最后,衰老的特征还表现为小鼠脾脏CD4+T细胞的耗竭标志物表达增加。尽管与CD8+T细胞相比,CD4+T细胞中T细胞耗竭的概念还没有得到很好的确立,但已经观察到具有高水平抑制性受体(如PD1和LAG3)的CD4+T细胞的丰度随着年龄的增长而增加。PD1+CD4+T细胞具有记忆表型,对TCR刺激不敏感,这与耗竭型CD8+T细胞的典型特征相匹配。耗竭型CD4+T细胞约占老年小鼠脾脏CD4+T细胞总数的30%。值得注意的是,与年龄相关的CD4+T细胞亚群的变化在整个组织中并不普遍。免疫细胞在4种小鼠组织中的scRNA-seq图谱证实了脾脏CD4+T细胞的重塑,并显示虽然在所有组织中都观察到了PD1+细胞的聚集,但Treg细胞仅在脾脏有明显的增殖。幼稚CD4+T细胞的年龄相关固有缺陷也在研究中被描述,这些研究使用转基因TCR的老年小鼠,在实验控制的抗原暴露下研究CD4+T细胞的衰老。

  这些研究表明,与年轻的CD4+T细胞相比,衰老的幼稚CD4+T细胞在体内和体外对激活的反应较差,它们的增殖能力降低,产生的IL-2也较少。TCR反应性的缺陷似乎特异地出现在循环中驻留较长时间的CD4+T细胞中,因为来自年轻胸腺切除小鼠的CD4+T细胞表现出这种表型,但进行年轻或老年的骨髓移植后并不表现出这种表型。此外,最近的一项scRNA-seq研究证明,从老年小鼠脾脏分离的幼稚CD4+T细胞对体外刺激的反应在转录水平上比年轻小鼠的幼稚CD4+T细胞更加异质和多变,这表明老年CD4+T细胞的激活程序受到的调控不那么严格。

  衰老的CD4+T细胞不完全分化为辅助性T细胞1(TH1)和TH2效应细胞被认为是一种紊乱的免疫激活调控。同时,衰老的CD4+T细胞获得TH17型表型的能力并未受到影响,造成免疫失衡并倾向于抗菌反应。在体量上,来自老年小鼠和人类的脾CD4+ T细胞比年轻对照组产生更多的IL-17,这可能反映了与年龄相关的TH17型记忆细胞的积累。由于TH17细胞与包括炎症性肠病在内的多种自身免疫性疾病的发生有关,可以推测老年人炎症性肠病流行的第二个发病高峰可能部分归因于T细胞群的这种倾向。事实上,将衰老的CD4+T细胞转移给Rag1-/-小鼠受体会比转移年轻供体的细胞引起更严重的结肠炎。然而,需要进一步的研究来证明这些事件之间的因果关系。IL-17产生细胞在老年小鼠淋巴结γδT细胞中也有过度表达,取代了在幼年动物中更为丰富的干扰素γ产生效应细胞γδT细胞。γδT细胞的数量随年龄以组织依赖的方式变化正如最近对多个小鼠组织的单细胞图谱研究结果。例如,γδT细胞在老年人的肝脏和肺中的出现频率较低,但在脾脏中则不常见。然而,在由小鼠β冠状病毒引起的急性肺部炎症条件下,老年小鼠的肺γδT细胞数量较少,可通过生酮饮食恢复。

  总之,上述的与年龄相关的T细胞群体差异似乎是老年动物体液免疫反应改变的部分原因。研究表明,CD4+T细胞在启动生发中心反应和产生高亲和力抗体方面是必需的。Eaton等人使用过继转移模型比较了转基因TCR的幼年小鼠和老年小鼠的幼稚CD4+T细胞促进的生发中心反应。在这项研究中,来自老年供体的幼稚CD4+T细胞的细胞内在变化导致生发中心的抗原特异性B细胞减少,并减少了类别转换抗体的产生。相比之下,幼鼠体内幼稚CD4+T细胞足以在老年环境中引起强烈的反应。这些观察结果突显了CD4+T细胞衰老生物学对于制定适合老龄人群的疫苗接种策略的重要性。

  TCR库:对TCR谱在衰老过程中变化的早期研究——首先使用TCRβ链特异性抗体,然后通过转录组测序--表明TCR多样性的丧失与进行克隆扩增的记忆性T细胞的增加有关,但也可以受到幼稚T细胞TCR多样性轻微下降的影响。总体而言,CD8+T细胞表现出比CD4+T细胞更大的克隆性增加,这与幼稚CD8+T细胞亚群随着年龄的增长而显著减少是一致的。scRNA-seq技术创造了一个独特的机会,通过在单细胞分辨率下对成对的α链和β链进行直接测序来研究TCR谱的复杂性,从而明确地定义了TCR克隆——这是通常只使用β链序列的转录组分析中所没有的特征。在小鼠中,最近证实与年龄相关的高度克隆性PD1+TOX+CD8+T细胞的积累导致CD8+T细胞增加。这些细胞的克隆性扩增是“特异的”,这意味着单个小鼠个体在T细胞克隆扩增所使用的特定TCRα链和β链上有所不同。因此,在所有衰老的小鼠中,T细胞可能并不能感知到共同的“衰老抗原”。未来仍需进一步研究来破译老年个体的单细胞免疫图谱并阐明驱动不同记忆T细胞亚群积累的年龄相关特定抗原。

  表1 衰老过程中主要免疫细胞群的变化。cDC1,经典I型树突状细胞;cDC2,经典II型树突状细胞;CX3CR1,CX3C趋化因子受体1;DC,树突状细胞;GZMK,颗粒酶K;ILC,固有淋巴样细胞;ILC1,第1亚群固有淋巴样细胞;ILC2,第2亚群固有淋巴样细胞;MAIT细胞,粘膜相关的不变T细胞;NK,自然杀伤细胞;pDC,浆细胞样树突状细胞;scRNA-seq,单细胞RNA测序;TEM细胞,效应记忆T细胞;Treg细胞,调节性T细胞。

  图2 衰老过程中免疫细胞群的变化:在老年小鼠的多个器官中使用单细胞技术鉴定出具有不同表型的增加和减少的免疫细胞群体。随着年龄的增长,耗尽的PD1+TOX+CD8+T细胞和激活的PD1+CD4+T细胞在多个组织中聚集,而自然杀伤(NK)细胞和天然淋巴样细胞(ILCs)是在不同器官中都出现丰度减少的细胞亚群。功能和表型相似的CD38+巨噬细胞在老年小鼠代谢活跃的器官--肝脏和脂肪--中增加。与许多组织中通常受年龄影响的细胞亚群不同,其他免疫细胞群体的变化在衰老过程中表现出器官特异性的模式。例如,在老年小鼠的脾脏中,激活的调节性T细胞(Treg细胞)数量增加。老年小鼠肺组织内肺泡巨噬细胞数量减少,纤维连接蛋白1(FN1+)、CC趋化因子受体2(CCR2+)间质巨噬细胞数量增加。衰老小鼠的脾脏(表达Zbtb32、APOE和Tbx21的B细胞)和腹腔(表达Zcwpw1和CTLA4的B1细胞)中聚集着不同的年龄相关B细胞亚群。cDC1为经典I型树突状细胞,ICAM1为细胞间黏附分子1,ILC1为第1亚群固有淋巴样细胞,ILC2s为第2亚群固有淋巴样细胞。

  在衰老过程中适应性免疫的重塑还包括B细胞组成和功能上的改变。一种表型和功能上分离的B细胞亚群已被发现在年老小鼠的脾脏和骨髓中扩张。这些细胞不同于传统的初始B细胞和记忆B细胞,被称为“年龄相关B细胞”。Hao等人将年龄相关B细胞定义为CD43-CD21/CD35-CD23-B细胞,而Rubtsov等人则将年龄相关B细胞鉴定为CD11b+CD11c+B细胞。有趣的是,年龄相关B细胞表达Tbx21(编码T-bet),这使得它们与已被证明促成小鼠狼疮样自身免疫的B细胞相似。尽管驱动这些B细胞亚群扩张的年龄相关因素尚未完全了解,但大量证据表明,与损伤相关的分子模式,如来自凋亡细胞的碎片和染色质,通过Toll样受体7(TLR7)或TLR9轴驱动了年龄相关B细胞。在老年小鼠中,年龄相关B细胞的产生、生存需要IFNγ信号传导。年龄相关B细胞可以通过改变免疫稳态来促进炎症。例如,年龄相关B细胞在激活时分泌IL-4和IL-10,并能将抗原呈递给T细胞。

  在过去的3年里,几项scRNA-seq研究报道了小鼠多个组织中B细胞的年龄相关动力学。在一项研究中,Kimmel等人对来自年轻和年老小鼠的3个组织的免疫和非免疫细胞进行了分析,发现脾脏中有一群独特的B细胞,随着年龄的增长而增多。该亚群通过载脂蛋白基因Apoe的表达被鉴定,但针对该B细胞亚群在免疫学命名上的精确身份尚未明确。前文所述的4种组织中小鼠免疫细胞的scRNA-seq分析研究定义了一个与年龄相关的脾脏经典B细胞群,它们表达转录因子基因Tbx21和Zbtb32以及编码其他年龄相关B细胞标志物的基因(如Cxcr3)。这种Zbtb32+B细胞亚群也高度表达Apoe,表明与Kimmel等人报道的与年龄相关B细胞群相似。脑膜中B细胞的单细胞分析显示,表达Apoe的年龄相关B细胞在老年小鼠的中枢神经系统边界处积聚。对单细胞B细胞受体(BCR)测序数据的分析为这一亚群提供了额外的见解。事实上,与年龄相关的脾脏B细胞已被公认为具有抗原经历B细胞特征的细胞,并伴有增加的体细胞超突变。此外,脾脏表达Tbx21的年龄相关B细胞簇显示BCR克隆性增加,同时仍然保留BCR库的多样性。

  另一项结合使用scRNA-seq和单细胞BCR测序的研究也报告了衰老小鼠中B细胞克隆性的逐渐增加。这一增长归因于在老龄小鼠的脾脏、骨髓、肾脏和脂肪中发现的一组表达浆细胞标记物Jchain、Xbp1和Derl3的细胞群,尽管比例很小(在这些组织中占大约0.1%)。此外,在小鼠的整个生命周期中追踪这一簇细胞显示,与年龄相关的B细胞相似,年龄相关的血浆B细胞最初出现在骨髓和脾脏中,随后在外周血组织(如脂肪组织和肾脏)中数量增加。在功能上,血浆B细胞可以产生促炎细胞因子,并在衰老的骨髓中促进骨髓生成。有趣的是,在老年人(≥70岁)的脂肪组织中,具有相似表型的血浆B细胞群数目大量增加。

  对腹膜腔免疫细胞进行的聚焦scRNA-seq分析发现,B1样细胞随着年龄的增长而大量积累,其特征是非常有限的BCR库。这些BCR高度富含VH11-2链,可识别细胞膜成分磷脂酰胆碱。与脾脏年龄相关B细胞类似,腹膜B1样细胞表达转录因子基因Zbtb32,但代表一个独特的转录簇,其特征在于高表达的一组独特的基因,包括Zcwpw1和Ctla4。Biragyn团队显示了与年龄相关的B1样细胞的积累,这是通过TNF配体超家族成员4-1BBL的表面表达在老年小鼠和人类中确定的。在功能上,B1样细胞随着年龄的增长而变得更加活跃,作为细胞毒性CD8+T细胞的有效诱导剂,并对共生细菌产生反应。单细胞研究的见解扩大了我们对年龄相关B细胞异质性的理解,并指出了年龄相关B细胞亚群的潜在抗原特异性及其在老年人中的组织特异性炎症功能。

  基质细胞在衰老中的免疫功能。免疫功能不仅限于造血干细胞,多种类型的基质细胞和上皮细胞也能够对病原体做出反应并参与免疫稳态调控。例如,成纤维细胞作为大多数组织的关键结构成分,是在病理状态和衰老中被广泛研究的一种基质细胞类型。转录分析显示小鼠年老成纤维细胞的真皮细胞群细胞特性的缺失,并伴有炎症基因的上调。类似地,一项对衰老成纤维细胞的转录组和表观基因组变化的分析发现,“活化成纤维细胞”(例如,参与组织修复的成纤维细胞)的数量增加,包括与细胞因子信号传递和炎症相关的通路。与小鼠的这些观察结果一致,对人类皮肤成纤维细胞的scRNA-seq分析表明,在不同的老年成纤维细胞群体中,导致轻度炎症的基因表达更高,并预测了成纤维细胞与老年皮肤中其他细胞类型之间的细胞-细胞通讯下降。

  内皮细胞排列在血管上并调节免疫运输。衰老似乎大大改变了各种组织中内皮细胞的炎症转录特征。例如,老年小鼠大脑中内皮细胞的单细胞转录谱明显发现与神经退行性疾病相关的炎症和细胞因子信号通路的改变。此外,在小鼠中,单细胞分析显示衰老肝窦内皮细胞的转录改变,这些细胞是免疫防御的重要调节因子。最后,内皮细胞和各种免疫细胞类型(包括巨噬细胞和T细胞)之间的通讯在年老组织中(包括肝脏和脂肪)发生了显著改变,这在大鼠的单细胞转录分析中同样被发现的。

  衰老细胞的促炎作用。衰老的特征是衰老细胞在全身逐渐积累(框 3)。作为细胞分化的一个终末阶段,衰老通常由细胞受损或受到压力产生,它导致细胞周期的永久停滞,并转换成一种独特的分泌表型。被称为“衰老相关的分泌表型”(SASP),涉及多种趋化因子、细胞因子和生长因子的分泌,并导致了在衰老过程中出现低水平的全身炎症。尽管已经在体外描述了衰老细胞的核心转录特征,但迄今为止还没有一种可靠的方法来确定体内衰老细胞的转录图谱。此外,即使在体外,衰老细胞的调节和SASP基因表达也存在很大差异。尽管如此,最近的scRNA-seq分析为衰老小鼠中衰老细胞的发育提供了一些见解。衰老小鼠组织的scRNA-seq图谱显示,在衰老小鼠的不同组织中,表达Cdkn2a(编码p16INK4A,一种常用的衰老细胞标志物的细胞)的细胞比例增加。然而,另一项单细胞分析发现,年轻小鼠和老年小鼠之间Cdkn2a的表达没有差异,这突出了目前的概念和技术限制阻碍了在活体生物中识别真正的衰老细胞的可能性。最近的一篇文章报道了在报告小鼠模型的scRNA-seq中发现有异质性衰老相关表型的p16INK4Ahi衰老细胞。有趣的是,衰老细胞包括多种类型的细胞,它们富集在肝内皮和肾近端和远端小管上皮中。清除这些p16INK4Ahi衰老细胞会降低代谢性肝病模型中的免疫浸润。需要进一步的研究,以更好地了解不同的衰老细胞如何促进低级别慢性炎症和重塑衰老中的免疫。

  细胞衰老是由于细胞复制阻滞、肿瘤抑制、炎症、胚胎发生、伤口愈合或与年龄相关的再生能力丧失而导致的不可逆细胞周期停滞状态。细胞衰老被定义为对发育和环境刺激的应激反应,包括基因毒剂、缺氧、线粒体功能障碍、致癌基因激活、表观遗传修饰剂和细胞因子。衰老细胞是细胞衰老的产物,结合了分子和形态上的特征。这些细胞经历与终末分化和静止不同的永久细胞周期停滞。它们重新连接了细胞周期调节通路,具有特定的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)磷酸化谱,并上调了CDK2抑制剂p21CIP1(也称为CDKN1A)和CDK4/CDK6抑制剂p16INK4A(也称为CDKN2A)的表达。尽管p21CIP1和p16INK4A的表达增加并不是衰老细胞所独有的,并且可以在如非衰老巨噬细胞中发现,但p21CIP1和p16INK4A经常被用作衰老细胞的标志物和开发成能选择性消除遗传模型衰老细胞的靶标。衰老细胞的形态学特征包括:由于稀释的胞浆区而增大的细胞大小、溶酶体衰老相关β-半乳糖苷酶活性的增加——最广泛使用的衰老细胞的组织学生物标志物。衰老细胞的其他特征包括DNA、蛋白质和脂质损伤、线粒体和溶酶体功能失调,以及改变的染色质景观。重要的是,衰老细胞具有特定的分泌特征,包括过度分泌促炎细胞因子和趋化因子、生长调节剂、血管生成因子和基质金属蛋白酶,统称为“衰老相关分泌表型”。衰老相关分泌表型的不同成分介导衰老细胞与免疫细胞的通讯,影响组织中基质细胞的功能,并导致衰老中的低度全身炎症表型。

  免疫细胞和衰老细胞之间的相互作用。通过特异性免疫细胞识别和消除衰老细胞是维持组织稳态和预防不良炎症的关键步骤。SASP的成分,例如CCL2和CCL7,会吸引免疫细胞,包括巨噬细胞、NK细胞和T细胞。衰老细胞也会吸引中性粒细胞,中性粒细胞的组织浸润是免疫衰老的标志之一。巨噬细胞在发育和病理过程中可以与衰老细胞发生相互作用并消除衰老细胞。衰老巨噬细胞的吞噬功能受损是否是衰老组织中衰老细胞积累的原因仍有待阐明。NK细胞识别并杀死衰老细胞以协调组织重塑并限制对急性组织损伤的纤维化反应。有趣的是,NK细胞和T细胞的细胞毒性功能似乎可以控制衰老细胞在衰老过程中的积累,因为缺乏穿孔素(细胞毒性的关键效应物)的小鼠在衰老时会表现出更高的衰老细胞组织负担和慢性炎症。与之一致的是,观察到衰老小鼠各组织中NK细胞下降,组织驻留CD8+T细胞被耗竭样PD1+T细胞取代。在小鼠实验中,通过基因操作消除衰老细胞,可以预防或延缓组织功能障碍,延长“健康寿命”(生物体免受衰老慢性疾病影响的时间),这表明免疫监测和消除衰老细胞有助于延缓与年龄有关的疾病。然而,免疫细胞介导的衰老细胞的消除是环境相关的,并且受到严格的调控,因为衰老细胞的短暂积累对于肿瘤抑制和某些再生过程(如伤口愈合)是至关重要的。

  图3 免疫细胞和衰老细胞之间的相互作用。衰老细胞响应衰老组织中的应激信号而从各种细胞类型中分化出来。衰老细胞的转录特征不同,并且在衰老相关分泌表型(SASP)中表现出异质性。先天免疫信号通路(包括p38丝裂原活化蛋白激酶和cGAS-STING通路)和转录因子(如NK-κB和GATA4)诱导细胞因子和组织重塑因子,构成SASP。在SASP组分中,生长因子(如转化生长因子-β(TGFβ))和基质金属蛋白酶(MMPs)会增加组织纤维化,而趋化因子和细胞因子会在衰老组织中产生促炎环境。SASP的趋化因子吸引可以与衰老细胞相互作用、识别和消除衰老细胞的免疫细胞。细胞毒性自然杀伤(NK)细胞和CD8+T细胞通过穿孔素依赖性机制识别和杀死衰老细胞。衰老细胞的这种消除是通过衰老细胞和细胞毒性细胞之间的特异性激活(MICA/ULBP2–NKG2D)和抑制性(HLA-E–NKG2A)配体-受体相互作用来协调的。此外,组织巨噬细胞可以通过胞吐作用找到并消除受损和消亡的衰老细胞。相比之下,SASP组分CXC-趋化因子配体1(CXCL1)和CXCL8对中性粒细胞的趋化作用会增加衰老组织中的衰老细胞负荷。中性粒细胞通过产生活性氧(ROS)驱动端粒功能障碍并诱导非免疫细胞衰老。衰老相关的耗竭样PD1+TOX+CD8+T细胞在年老组织中的积累可通过促炎颗粒酶K(GZMK)增强SASP的表达。CCL,CC-趋化因子配体;IFNβ,干扰素-β。

  虽然单细胞技术及其在小鼠各种组织中的免疫衰老中的应用取得了巨大进展,但是目前人类的单细胞数据通常仅限于来自血液的免疫细胞群(表1)。尽管如此,对现有数据集的比较表明,小鼠和人类不同的免疫细胞亚群随着衰老而产生的变化存在一定程度的相似性。例如,当这两个物种衰老时,单核细胞数量增加,而浆细胞样树突状细胞数量减少。同样,在老年小鼠和老年人中,幼稚CD4+T细胞和CD8+T细胞以及表达SOX4的γδT细胞数量较少。此外,细胞毒性CD4+T细胞和GZMK+CD8+TEM细胞在衰老过程中普遍积累。这些研究结果表明,小鼠和人类具有同样影响这些免疫细胞群的未知年龄相关因素。可能的原因之一是SASP的促炎成分,这是老年小鼠和老年人的共同特征。重要的是,与通常生活在无特定病原体条件下的实验室小鼠不同,人类的免疫系统不断受到感染史的重塑,并且一些慢性病毒感染(如巨细胞病毒感染)在人类免疫衰老中的作用已被充分记录。与小鼠相比,这一感染和其他感染可以解释老年人CD8+T细胞亚群中更复杂的年龄相关改变模式。此外,这可能是scRNA-seq揭示的这些物种中年龄相关的B细胞之间没有直接表型相似性的原因。此外,目前我们对人体组织驻留免疫细胞(包括巨噬细胞、T细胞和ILCs)如何衰老的了解很少,未来的单细胞研究将有利于加深这一了解。

  单细胞技术已经显著扩展了当前的免疫衰老的研究范式,如可以更好地了解人类CD8+TEM细胞的异质性,并区分GZMK+和GZMB+TEM细胞群,揭示了GZMK+细胞是人类中与年龄相关的CD8+TEM细胞亚群。单细胞分析还将细胞毒性CD4+T细胞定义为小鼠和人类之间保守的免疫衰老的一个关键特征。结合抗原受体的单细胞RNA测序技术将我们研究TCR和BCR的能力提高到一个前所未有的水平。这一扩展工具的最新发现之一是,小鼠CD8+T细胞中TCR库多样性的年龄相关损失,似乎主要是由寡克隆PD1+TOX+CD8+T细胞取代多克隆幼稚T细胞和TEM细胞所致。最后,对多个组织的免疫细胞进行无偏倚的单细胞分析,结果表明,有益于健康长寿的饮食干预策略不仅可以重塑受年龄影响的免疫图谱,还可以具体地重新编程啮齿类动物中独特的促炎巨噬细胞亚群。这些结果表明了一种有趣的可能性,即某些免疫细胞群可能是未来衰老干预疗法的目标。

  下一代分析技术将允许进一步探索免疫衰老领域的许多悬而未解的问题。例如,免疫细胞与衰老环境之间的相互作用是研究的重要方向,包括了解哪些过程是由免疫细胞驱动的,哪些反映了免疫细胞对衰老环境的适应。空间转录组学和成像细胞术可以揭示免疫细胞和非免疫细胞之间的空间关系,并有望以无偏倚的方式解决这个难题。此外,组织驻留的免疫细胞群在老年人中的研究还不够充分。因此,空间技术将成为人类免疫衰老研究的重要基础。这种方法对于更好地了解老年人对病原体的免疫反应尤其重要,在老年人中,与年轻人相比,肺炎、流感病毒和COVID-19等一些(不是全部)病毒和细菌感染的严重程度大大增加。对不同年龄的个体进行单细胞分析,可以区分衰老与传染病本身的影响,这将有助于差异化研究年龄相关的变化与疾病的免疫机制,如COVID-19等老年易感传染病。

  单细胞免疫学的另一个前沿是通过正交方法的多路复用来表征衰老的免疫系统。例如,同时表征单个免疫细胞中成百上千的基因和蛋白质(例如,使用CITE-seq)将加深免疫分析,并促进免疫细胞在衰老过程中功能的预测和验证。同样的方法也适用于衰老免疫细胞的转录组学和表观基因组学的组合。scRNA-seq和scATAC-seq的并行应用,在小鼠和人类CD8+T细胞的年龄相关免疫细胞群中破译新的调控方式已经显示出令人鼓舞的潜力(表2)因此,在单细胞水平中,scRNA-seq和scATAC-seq的结合有助于识别免疫系统随衰老环境调控的关键功能通路和潜在的表观遗传图谱。

  表2 免疫衰老的单细胞转录组和表观遗传数据集。CITE-seq,通过测序对转录组和表位进行细胞索引;PBMC,外周血单核细胞;scATAC-seq,转座酶可及染色质的单细胞测序;scBCR-seq,单细胞B细胞受体测序;scRNA-seq,单细胞RNA测序;scTCR-seq,单细胞T细胞受体测序。

  细胞衰老与各种年龄相关的表型和疾病有关,但需要进一步研究以确定衰老细胞在这方面的致病作用。在目前单细胞水平(尤其是在体内)识别真正衰老细胞的概念和技术限制了我们捕捉衰老细胞和免疫细胞之间相互作用的能力,难以更好地了解SASP在炎症中的作用。未来可选择的方法可能依赖于mRNA和蛋白质的组合测量以及单个细胞中大分子损伤的特定功能标记。此外,尽管有充分证据证明靶向消除衰老细胞的益处,但这如何影响衰老的免疫系统仍有待了解。

  最后,研究免疫衰老的一个具有挑战性的问题是小鼠和人类衰老表型的巨大差异。由于衰老的生理表现取决于基因型、病史和环境的组合,因此了解这些因素在衰老过程中如何影响免疫系统至关重要。此外,在影响健康寿命的各种风险因素的背景下研究免疫衰老。例如,在多遗传关联研究中识别导致衰老的功能性衰退可变性的遗传因子。未来的单细胞研究可以加深我们对这些因素和其他因素如何影响不同年龄的不同免疫细胞群的理解。通过应用小鼠免疫衰老模型,这将促使研究人员严格控制由相关生理过程衍生而来的衰老效应(例如,脂肪组织的活性下降与积累)。同样,对不同年龄的表型和遗传多样化的个体的免疫系统进行单细胞分析,将有助于揭示免疫系统适应老年环境的重要机制。在整个生命周期的单细胞研究(横向和纵向)中增加时间维度是深入刻画小鼠和人类个体免疫衰老轨迹的一个主要未来方向。例如,跟踪健康免疫衰老中的时序多维度变化或年轻个体与年老个体对感染的免疫反应的不同阶段是未来的一个关键目标。

  总而言之,为免疫衰老的单细胞研究增加空间、时间、深度和多样性是该领域的下一个目标。

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